应用基因基础方法检测微生物

致病菌与食品安全息息相关。在食物链的各个环节广泛存在多种食源性致病菌，如沙门氏菌、单增李斯特菌等都是非常强烈的致病菌。它们在一些特殊环节中，像大肠杆菌，尤其是在绞细牛肉、未加工的蔬菜、野味肉、奶酪里广泛存在；在海产品里，霍乱弧菌和副溶血弧菌也是非常严重的致病菌。另外，在农场中，运输过程中、加工过程中甚至在消费者购买后，都会存在病原菌侵害。 对于食品加工企业而言，他们最大的挑战是确保终产品的安全性，并将食品对消费者的潜在危害最小化。从宏观角度，食品安全规划已经成为集卫生监测和控制为一体的协同工作。因此，食品加工企业和相关权威检测机构在食品安全的检测方面，急需精确、灵敏、快速的病原菌检测系统。 　　食品安全最基本的问题———食品中是否有病原菌存在，看起来是一个非常简单的问题，但是要寻找答案却绝非易事。缺乏有效的致病菌检测方法，就是一个很大的难题。 　　致病菌检测要求精确性———可靠检出食品中是否有病原菌存在，并排除假阳性的结果；迅速———提供快速的检测结果，从而使快速应急反应成为可能。在这个环节，相关职能部门可以迅速做出应急反应预案，对消费者进行保护，这也是非常具有挑战性的要求。 　　致病菌检测面临的挑战病原菌通常是非均匀分布的，所以对病原菌取样需要有一定的要求；有些病原菌含量非常低，要做到的灵敏性必须在低污染水平也能被检出，如每25克样品中含有1个目标菌落。对病原菌进行筛选首先要找到一个合适的样本，有代表性地取样，然后进行增菌和筛选。细菌的筛选方法通常有：培养法———通常在培养基上培养的菌落大约需要2～9天时间；免疫测定法———基于抗原－抗体反应，24～48小时得到假定的结果；分子学方法———基于DNA基础，8～48小时即可得到精确的结果。 　　前面两种方法，既耗时又复杂。最初产品预增菌需要1天的时间，后面再进行选择性的增菌还需要1～2天，再进行生化鉴定，确定分离菌落，时间较长。尽管如此，培养方法也有很多优势，如它是被广泛采用的“金”标准，被用于对照实验，可以提供1个菌落，操作成本低等。但它的弱势也非常明显，检测速度慢，对实验人员的操作水平有很高的要求。免疫测定方法到现在有近20多年的历史了，它大大优于传统的培养方法———一种基于抗原－抗体的反应的检测方法。相对于传统方法而言，免疫测定法有很多优势：可迅速得到假定的结果，具有官方检测单位的批准，广泛地被业界接受，可自动化、费用相对低。劣势：基于表型分析的技术，交叉反应导致假阳性，灵敏度相对低，只有致病菌达到106CFU／毫升才能被检出。这意味着需要多做1～2天的增菌培养，才能达到检测的数量。 　　分子学方法到目前为止，被证实为对致病菌的检测和筛选最先进的方法。其中，一种是多聚酶式链式反应（PCR），另一种是DNA杂交。多聚酶式链式反应（PCR）用一个特异性的底物来对靶细菌DNA的某一个片断进行扩增，通过系统本身来进行检测。DNA杂交法是用一种特殊的探针跟踪目标细菌DNA片段去结合、杂交，因为它在整个反应中没有扩增的过程，所以，它只需要增菌的时间，与免疫方法是相似的。PCR的优势：对目标DNA进行检测，比培养方法快速，比免疫测试方法灵敏，只需要103～104数量级就可检出，这意味着至少可以节省102数量级增菌时间。劣势：很难直观检测，检测相对复杂，需要实验室人员有非常强的操作技术。 　　PCR在病原菌筛选上的应用 　　到目前为止，PCR方法已作为常规微生物检测手段被广泛采用。每个PCR反应循环基本由3个步骤组成。第一个是变性 ：DNA随着温度升高而解链，由双链结构变成单链结构。第二是引物退火：随着温度降低，引物与 　　目标DNA结合，即与单链DNA结合。第三是延伸：提供反应所需引物以延伸DNA。之后，此循环重复扩增过程35～40次，在2～8小时内，即可产生超过300亿个DNA拷贝。BAX系统如何应用PCR方法进行致病菌检测杜邦Qualicon的BAX全自动病原菌筛选系统是全球第一台商用PCR系统，其研发伊始只是尽可能地简化PCR应用，把 　　PCR作为微生物检测的常规方法，另外可以作为验证方法使用。BAX系统由检测单元、工作站和打印机组成。PCR反应在检测器中自动完成，试剂盒已经做成冻干药片，内含反应所需引物和阳性对照，并预装在闭盖试管中，便于使用和运输。目前，已有5种商品化的检测试剂盒：沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌O157 ：H7、李斯特菌、坂崎肠杆菌。BAX系统只有简单的4个步骤：样品增菌→DNA制备→DNA扩增→DNA检测。由于PCR方法的灵敏性，它的增菌时间也大大少于培养方法和免疫方法。比如，沙门氏菌只需要18～20小时就可以完成增菌的过程，在增菌后进入DNA制备过程，只需要简单的升温、破壁，就可以释放出DNA，通过试剂盒配套的缓冲剂就可以提取出DNA。扩增的步骤是全自动的，在扩增结束后，系统会自动将结果直观地显示在电脑屏幕上。另外，BAX系统具有强大灵活的处理能力，一次最多可以检测96个样品。 　　BAX系统已获得包括美国农业部食品安全检测署、官方农业化学家协会等权威机构及欧盟一些国家的官方认证，全球10大食品企业中已有8家采用BAX系统作为其实验室病原菌的检测系统。作为致病菌检测系统，它还可用于服务性检测实验室，官方检测机构，公共卫生实验室等。 　　对致病菌的检测有两个非常重要的要求，一是精确，二是快速，BAX系统能够从根本上解决这两个难题。由于其平台的友好性，可以被更广泛地应用。而且，杜邦Qualicon一直致力于更新升级系统并将不断研发出新的检测试剂，如弯曲杆菌、弧菌等正在作为后续的目标细菌在研发过程中。除病原菌外，杜邦Qualicon还将涉足病毒的检测，如口蹄疫、禽流感病毒的试剂盒研发。